4、细菌-3 ...
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（一）获得纯培养的方法
纯培养：一个细胞/一群相同经过培养繁殖得到的后代建立纯培养，证实其纯度无可置疑并保持不受污染是微生物最重要任务之一。
五菌技术：
1.用于分离培养的器具不含任何微生物
2.在转接培养微生物时防止其他微生物污染
接种操作：以火焰为中心，直径5cm以内。
①液体稀释法（细胞较大的微生物）
首先将待分离的样品进行连续稀释，目的得到高度稀释的效果。使一支试管中分配不到一个微生物，如果经过稀释后大多数试管中无数微生物生长，那么有微生物生长的试管得到培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。
②平板划线分离法
特点：快速、方便
分区划线：适于浓度较大样品 连续划线：适于浓度较小样品
③平板涂布分离法
细菌、酵母菌选取平均菌落数小于300cfu，霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌落报告（取两位有效数字）的依据，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告供试品中所含的菌落数。
技术要求：样品充分混匀；严格无菌操作
注意事项：每一支吸管只能用一个稀释度；样品混匀处理，每个稀释度应有三个以上重复，取平均值。
适用范围：中温，好氧和兼性厌氧，耐氧菌。
误差：1多次稀释造成误差2样品内菌体分布不均匀3不当操作
④倾注平板法
（二）微生物群体生长的测定方法
选用不同种类，不同生长状态的微生物生长状态情况，需选用不同测定指标
1.微生物细胞数目的监测方法
直接法（血球计数板比列计数法）
间接法（活菌数计数法液体稀释法膜过滤法）
2.微生物生长量和生理指标测定法
直接法（干重法堆体积法）
间接法（比浊法碳氮含量法其他生理指标）
①血球计数板法
原理：将1mm?×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地取80或100小格，计数其中细胞数目，换算成单位体积中细胞数。
适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球酵母菌，霉菌孢子。
特点：1不适用细菌等个体较小的细胞2不能区分死活细胞，可在菌悬液中加入少量美蓝以区分（死细胞蓝 活细胞无）3快速准确对酵母菌可同时测定出芽率
②平板菌落计数法
技术要求：样品充分混匀，严格无菌要求操作
注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度样品混匀处理，每一个稀释度应有三个以上重复，取平均值。
适用范围：中温，好氧和兼性厌氧，耐氧菌。
误差：1多次稀释造成误差2样品内菌体分布均匀3不当操作
③薄膜过滤法
适用：常用该法待定含菌量较少的空气和水中微生物数目
将定量的样品通过滤薄膜过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。
④干重（湿重）法（菌浓度较高样品）
将一定量的菌悬液中的菌体通过离心或过滤分离出来，然后烘干（可采用105℃、100℃或80℃）称重。
一般干重为湿重的10%~20%，而一个细菌细胞一般重约10负12次方~10负13次方g
例：大肠杆菌一个细胞一般重约10负12次方~10负13次方g.
液体培养物中细胞浓度达到2×10的9次方个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。
⑤比浊法：
原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与浑浊度成正比，既光密度成正比。
特点：快速、简便、但易受干扰。
注意：1测得结果既包括活菌又包括死菌2样品颜色不宜太深3样品中不应该含有杂质，否则不能使用。
⑥生理指标法
测含氮量：蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。
一般细菌含量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%
其他方法：含碳、核酸、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸等都可以用于生长量的测定。
○细菌常用比浊法及平板菌落计数法，其中平板菌落计数法即可分离纯化，又可用于菌落计数。
