《药用微生物技术》压缩包

5、细菌-4.细菌的生长与繁殖

　　一、细菌的化学组成主要是水和固体成分。其中，水分约占菌体重量的80%，固体成分包括蛋白质、核酸、脂类、无机盐等，约占菌体重量的20%。
　　二、细菌的营养物质
　　根据营养物质分为自养菌和异养菌
　　光能自养菌：光 CO?蓝细菌、藻类
　　光能异样菌：光有机物红螺细菌
　　化能自养菌：无机物 CO?硫化细菌
　　化能异样菌：有机物有机物绝大多数细菌
　　1.水
　　①作为良好溶剂，细菌对物质的吸收和运输须在水中进行②参与细菌代谢过程中所有的生化反应，并提供氢、氧元素。③有效散发代谢过程中释放的能量，调节细菌温度。
　　2.碳源
　　细菌代谢主要能源，合成菌体必需的原料。碳源分为无机碳源和有机碳源两类，除自养菌能以CO?作为唯一碳源外，大多数细菌以有机含碳化合物作为碳源如葡萄糖、麦芽糖等都能被细菌吸收利用，致病性细菌主要从糖类中获得碳源。
　　3.氮源
　　细菌可以用各种含氮化合物合成自身的蛋白质、核酸以及其他含氮化合物。多数病原性细菌利用有机含氮化合物作为氮源，如氨基酸、蛋白胨等；固氮菌等少数细菌能以空气中的游离氮或无机氮作为氮源，如硝酸盐、铵盐等。
　　4.能源
　　微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质和辐射能。主要有光能（少数微生物能利用）和化学能（绝大多数微生物能利用）。在能源中，某些营养要素只有一种功能，如光能仅提供能量；而有些营养物质具有多种功能，如铵根离子是硝酸细菌的氮源和能源物质，蛋白质、氨基酸等同时具有作为碳源和能源的功能。
　　5.无机盐
　　在细菌细胞中以离子的形式存在，是细菌生长代谢的重要营养物质。细菌中各类无机盐的主要作用：①构成均体成分②调节菌体内外渗透压③促进酶的活性或作为某些辅酶组分。④某些元素与细菌的生长繁殖、致病性密切相关。如白喉棒杆菌产毒株，其毒素产量明显受到培养基中铁含量的影响，当培养基中铁浓度降至7mg/L时，可使白喉棒杆菌毒素产量显著增加。
　　6.生长因子
　　某些细菌在生长过程中必需的、需要量少但又自身不能合成的一类有机物质，包括维生素、某些氨基酸、脂类、嘌呤、嘧啶等。
　　三、细菌营养物质的吸收方式
　　1.单纯扩散（simple diffusion）：
　　物质浓度由高到低，运输过程中的动力是菌体内外溶质的浓度差，运送的物质主要是氧、水分、甘油等分子。该方法不是细胞吸收营养的主要方式。
　　3.促进扩散（facilitated diffusion）
　　物质浓度由高到低，有特异性载体蛋白协助物质转运，不需要耗能。该方法可加快膜运送物质的速度，直到细胞内外浓度达到平衡。
　　4.主动运输（active transport）
　　物质浓度由低到高，需要膜上的特异性载体蛋白参与，要耗能。运送物质主要有氨基酸、乳糖、无机离子等物质。该方法是细菌吸收能量的主要方式。
　　5.基因转运（group translocation）
　　物质浓度由低到高，需要特异性载体蛋白参与，要耗能，因溶质在运送前后会发生分子结构的变化，因此不同于主动运输方式。运送的物质主要有葡萄糖、果糖、核苷酸等物质。
　　四、细菌的生长繁殖
　　（一）细菌生长繁殖的条件
　　1.适当营养
　　水、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等为细菌的新陈代谢、生长繁殖提供必需的原料和足够的能量。
　　2.适宜温度
　　不同细菌对温度要求不同，过高或过低都不利于其生长。根据细菌对温度的适应性，细菌可分为嗜冷菌、噬温菌和噬热菌。嗜冷菌最适生长温度小于20℃，噬温菌的最适生长温度为20~40℃，噬热菌在高至56~60℃中生长最好。病原性细菌均为噬温菌，最适温度为37℃，与人体体温相近，实验室培养细菌往往在37℃培养。
　　3.合适PH
　　大多数细菌最适PH6.8~7.4，在此范围内细菌的酶活性最强。少数细菌在碱性条件下生长良好，如霍乱弧菌在PH8.4~9.2时生长最好。也有的细菌最适PH偏酸，如乳酸杆菌最适PH5.5。人类的血液、组织液PH7.4，细菌易生存；胃液偏酸，绝大多数细菌可被杀死。在实验室中培养细菌时，由于细菌代谢过程中分解糖产酸，使PH下降而影响菌体生长，所以培养基中应加入缓冲剂以保持PH稳定。
　　4.必要气体环境
　　主要指O?和CO?。一般细菌代谢中都有CO?,但大多数细菌代谢所产生的CO?即可满足自身需求。根据细菌对O?的需要不同，细菌可分为：①专性需氧菌：既必须在有氧的环境下才能生长繁殖的细菌，如结核杆菌、枯草芽孢杆菌。②专性厌氧菌：即在无氧环境下才能生长繁殖的细菌，如破伤风杆菌。③兼性厌氧菌：即在有氧或无氧环境下均能生长繁殖，但在有氧时生长更好的细菌，多数病原菌都是兼性厌氧菌。
　　专性厌氧菌在有氧条件下生长受到抑制，可能原因：①厌氧菌缺乏细胞色素与细胞色素氧化酶，不能氧化那些氧化还原电势较高的氧化型物质②厌氧菌缺乏过氧化氢酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD），不能清除有氧环境下所产生的超氧离子（O??）和过氧化氢（H?O?），因而难以存活。③有氧条件下，厌氧菌某些酶的－SH基被氧化为－S－S－基，导致酶失去活性。
　　（二）细菌的繁殖方式和速度
　　1.细菌的繁殖方式
　　细菌主要以无性二分裂方式进行繁殖。细菌吸收营养物质生长发育到一定阶段，细胞体积增大，在细胞中间逐渐形成横隔，由一个母细胞分裂成两个大小相等的子细胞。细菌细胞分裂是连续的，两个子细胞正在形成之际，又在子细胞的中央形成横隔，开始第二次分裂。有的细胞分裂后形成多种排列方式。
　　2.细菌个体的繁殖速度
　　细菌繁殖速度极快。细菌分裂增殖的必须时间，成为时代（generation time），细菌代时的长短取决于细菌的种类，同时又受环境影响。细菌代时一般为20~30min，个别细菌较慢，如结核分枝杆菌繁殖一代需15~18h。若以大肠埃希菌的代时为20min计算，在最佳条件培养8h后，1个细菌可繁殖到200万个以上，10h后可超过10亿个，24h后细菌繁殖的数量可庞大到难以计算的程度。但实际上，由于细菌繁殖中营养物质的消耗、毒性产物的积聚以及环境PH的改变，细菌绝不可能始终保持原速度无限增殖，一定时间后细菌活跃增殖的速度会逐渐减慢，死亡菌数增加、活菌数减少。
　　3.细菌群体的生长繁殖
　　将一定数量的细菌接种于适当的培养基，定时取样计算细菌数，用于研究生长过程的规律。以培养时间为横坐标，细菌数的对数为纵坐标，可得到一条生长曲线。
　　根据生长曲线，细菌群体的生长繁殖可分为四期。
　　（1）迟缓期：为细胞接种至培养基后适应环境、繁殖前的准备时期，一般为1~4h。特点：细菌不分裂，菌数不增加，细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂储备充足的酶、能量及中间代谢产物。
　　（2）对数期：又称指数期，特点：细菌生长繁殖迅速，菌数以几何级数增长。对数期细菌的形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，是研究细菌性状、做药物敏感（药敏）试验的最佳时期。
　　（3）稳定期：此时培养基中营养物质消耗，有机酸和HO等毒性产物积累，PH下降等不利因素出现。特点：细菌繁殖速度逐渐下降，细菌繁殖数和死亡数趋于平衡，活菌数保持相对稳定；细菌形态和生理特性逐渐发生改变，芽孢多在此期形成；产生相应的代谢产物，如外毒素、内毒素和抗生素等。
　　（4）衰退期：特点：细菌繁殖速度越来越慢，细菌死亡数超过繁殖数；细菌形态显著改变，如变长、肿胀、畸形，甚至菌体自溶；生理代谢活动趋于停滞。
　　指导意义：
　　生产中可选择适当的菌种、菌龄、培养基以缩短迟缓期；
　　在无菌制剂的制备中应把灭菌工序安排在迟缓期以减少热原的污染；
　　在实验室实训时则需尽量采用处于对数期的细菌做为实验材料；
　　在发酵工业上，为获得更多的代谢产物，可适当调控和延长稳定期；
　　利用芽孢在衰退期成熟，可保藏菌种。
　　五、细菌的人工培养
　　（一）培养基及分类
　　培养基（culter medium）是人工配制的、适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质。培养基应具备的条件：①含有合适的营养物质②具有适当的PH③灭菌后维持无菌状态。
　　1.按培养基的营养成分和使用目的不同分类
　　（1）基础培养基：含有能满足一般细菌生长繁殖所需要的营养物质。如肉汤培养基，由牛肉浸膏或肉汤、蛋白胨、氯化钠和水等组成。
　　（2）营养培养基：在基础培养基中加入诸如血液、血清、酵母浸膏等营养物质，以满足对营养要求较高或有特殊营养要求的细菌的生长。如链球菌需要在血琼脂平板上才能生长。
　　（3）选择培养基：利用不同细菌对化学药物的敏感不同，在培养基中加入一定的化学物质以抑制某些细菌的生长，从而筛选出目的菌。如在培养基中加入胆酸盐，能选择性地抑制革兰氏阳性菌的生长，便于革兰氏阴性菌的生长，该法常用于肠道病原菌的分离。
　　（4）鉴别培养基：由于不同细菌生化能力有差异，在基础培养基内加入特殊的底物和指示剂，可达到鉴别细菌的目的。如细菌的糖发酵试验，可根据细菌分解糖类产酸产气以及指示剂的变色来鉴别。（曙红亚甲蓝琼脂、麦康凯琼脂）
　　（5）厌氧培养基：专门用于厌氧菌培养与鉴别的培养基。厌氧培养基一般含有特殊的营养物质，氧化还原电位低，利于厌氧菌生长。常用的厌氧培养基有疱肉培养基、六基乙酸钠培养基等。
　　2.按培养基物理状态的不同分类
　　（1）固体培养基：因含有凝固剂而呈现固体状态的培养基。常用的凝固剂是琼脂（agar）。琼脂是一种从海藻中提取的多糖类物质，熔点为96℃，冷却到45℃以下即可凝固。琼脂非细菌的营养物质，仅作为赋形剂使用，在液体培养基中加入1.5%~2%的琼脂即可制成固体培养基。固体培养基在科学研究和生产实践上有着广泛的用途，可用于分离、保存、纯化和活菌计数等。
　　（2）半固体培养基：与固体培养基相比，半固体培养基中的琼脂加入量为0.2%～0.8%，硬度低。主要用于细菌鞭毛有无的鉴别，即监测细菌有无运动能力。
　　（3）液体培养基：不需要加琼脂，培养基各组分均匀分布，微生物能充分利用培养基中的养料。实验室常用液体培养基为营养肉汤；发酵工业中使用的种子培养基和发酵培养基也是液体培养基，可用于细菌生理学研究、摇瓶培养以获得大量菌体以及工业化的生产。
　　除上述两种分类方法外，培养基还可以按照微生物种类不同分为细菌培养基、放线菌培养基和真菌培养基；按培养基的成分不同分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基等。
　　（二）细菌在培养基中的生长现象
　　将细菌接种到培养基中，放置于恒温箱37℃培养18~24h，可肉眼观察到细菌的生长现象。
　　1.细菌在液体培养基中的生长现象
　　（1）均匀浑浊：大多数兼性厌氧菌在液体培养基中为均匀分散生长，整个培养基呈现均匀浑浊现象，如金换色葡萄球菌。
　　（2）液面菌膜：某些转性需氧菌在液体培养基中进行表面生长，在液体上形成菌膜，如枯草芽孢杆菌。
　　（3）沉淀：少数呈链状的细菌如链状球菌，在液体培养基中生长时可沉积在培养基的底层，表现出沉淀生长现象。
　　2.细菌在固体培养基的生长现象
　　（1）在琼脂斜面上生长现象：将细菌在斜面培养基上划线培养后，可看成连成一片的纯培养物，称为菌苔（bacterial lawn）
　　（2）在琼脂平板上的生长现象：将细菌在琼脂平板上划线培养后，有单个细菌繁殖而成的肉眼可见的细菌集团称为菌落（colony），每一个菌落通常是由一个细菌不断分裂增殖堆积形成的细菌纯种。不同细菌的菌落有不同的特点，表现在菌落的大小、形状、色泽、边缘、透明度、湿润度、表面光泽度等方面有差异，可用于细菌的鉴别。
　　3. 细菌在半固体培养基中的生长现象
　　用穿刺接种法将细菌接种在半固体培养基中培养，有鞭毛的细菌能沿着穿刺线扩散生长，使穿刺线模糊不清呈放射状或云雾状：无鞭毛的细菌只能沿着穿刺线生长，穿刺线的周围的培养基仍较透明。
　　（三）细菌的人工培养在医药上的应用
　　1.疾病的病原学诊断和治疗
　　在诊断某些传染病时，需要将患者体内的病原性细菌进行纯培养，鉴定其种类后才能确定是患了哪种疾病。同时，病原菌确定后，需做药敏试验以找出该菌敏感的药物，为临床治疗提供合理的用药选择。
　　2.细菌学研究
　　研究细菌的生理特点、遗传变异性、致病性和免疫性等，均离不开人工培养细菌。
　　3.生物制品的制备
　　生物制品研制单位在研制菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素和免疫血清时，都必须对纯种细菌进行筛选和培养。
　　4.基因工程
　　利用细菌具有易培养和繁殖迅速特点，在基因工程中细菌常作为基因受体细胞来使用。